Sci Adv︱刘兴国/田梅团队发现药物诱发帕金森综合征中线粒体清除新机制

撰文︱谢耀航，肖嘉慧，李岳樵，包飞翔

责编︱王思珍

帕金森综合征（Parkinson’s syndrome）是一种常见于老年人的神经退行性综合征，病理学上呈现出大脑内多种解剖结构的变性，黑质（substantia nigra）和纹状体（striatum）中多巴胺水平降低[1]。帕金森综合征的病因较为广泛，如遗传、衰老、环境应激等，药物诱发的帕金森症（drug-induced parkinsonism）是仅次于原发性帕金森综合征的第二大帕金森症。氟桂利嗪（flunarizine）是具有钙拮抗和抗惊厥特性的药物，广泛用于治疗中枢和外周起源的眩晕，偏头痛，癫痫和闭塞性外周血管疾病[2]。然而，氟桂利嗪副作用之一包括导致帕金森综合征，其原因可能是氟桂利嗪抑制了多巴胺受体功能[3]。

线粒体质量控制是正常的细胞功能所必需的，受损的线粒体主要通过线粒体自噬（mitophagy）来清除，最明确的机制之一是PINK1-PARK2依赖性途径[4]。受损线粒体也可以通过其他自噬途径清除，包括BNIP3L或FUNDC1依赖性线粒体自噬，ULK1调节的非经典自噬通路和线粒体来源的囊泡（mitochondrial-derived vesicles，MDVs）外泌等方式[5,6]。

线粒体异常也是帕金森综合征的因素之一，氟桂利嗪能够抑制组织衍生的亚线粒体颗粒中线粒体电子传递链的配合物I和II[7]。目前，氟桂利嗪诱导的帕金森综合征的确切机制尚未阐明，线粒体质量控制在帕金森综合征中的角色也仍有待探索，研究此类问题对于预防和治疗神经退行性疾病具有重要意义。

2022年4月13日，中国科学院广州生物医药与健康研究院刘兴国课题组和浙江大学田梅课题组合作Science Advances上发表了题为“Mitolysosome exocytosis, a mitophagy-independent mitochondrial quality control in flunarizine-induced parkinsonism-like symptoms”的研究成果，阐明了氟桂利嗪诱导帕金森症的一种可能机制：被诱导的细胞通过线粒溶酶体（mitolysosome）——一种溶酶体包裹着线粒体的胞内结构——以胞吐的方式将线粒体排到细胞外，从而减少细胞中的线粒体总量，进而引发帕金森症。

作者用氟桂利嗪处理ICR小鼠后发现其在转棒测试、旷场和水迷宫等实验中都有帕金森综合征表现。研究人员采用正电子发射断层显像和X射线断层扫描（PET-CT）表明氟桂利嗪导致脑葡萄糖摄入升高。进一步实验发现神经前体细胞的线粒体相应减少（图1 A, D, G），说明氟桂利嗪对脑细胞具有广泛损害性。体外实验显示了线粒体数量的减少、细胞呼吸速率的下降和细胞糖酵解活动的增加。作者用探针标记、敲降敲除相关自噬因子、添加抑制剂等方法排除了PINK1-PARK2、ATG5、ULK1/RAB9等经典或非经典自噬途径。

图1 氟桂利嗪（FNZ）诱导小鼠多巴胺能神经元和星形胶质细胞线粒体含量降低

（图源：Bao, et al., Sci Adv,2022）

作者发现氯喹（chloroquine, 溶酶体水解酶抑制剂，能阻止自噬体融合和降解）能够抑制氟桂利嗪诱导线粒体清除效应。共聚焦、荧光显微技术和透射电镜等实验发现线粒体大量定位于溶酶体中（图2 A-D），作者将该结构命名为线粒溶酶体（mitolysosome）。进一步，作者用多种探针标记细胞膜、线粒体和溶酶体，发现细胞可能通过胞吐作用将线粒体排出（图2 E），并通过检测胞外的线粒体DNA和蛋白质初步进行了验证。

图2 线粒体通过溶酶体依赖性胞吐被清除

（图源：Bao, et al., Sci Adv,2022）

进一步地，胞内钙离子浓度升高能够有效阻止氟桂利嗪清除线粒体，说明溶酶体胞吐在其中起作用。作者用shRNA干扰溶酶体融合分泌有关的蛋白表达，发现VAMP2（vesicle associated membrane protein 2，囊泡相关膜蛋白2）和STX4（syntaxin 4，突触融合蛋白）能够阻止胞吐作用（图3），进而阻碍氟桂利嗪清除线粒体。综上，该研究发现氟桂利嗪诱导线粒体被溶酶体包裹形成线粒溶酶体（mitolysosome），并通过VAMP2和STX4依赖性胞吐分泌到胞外。最后，通过基于全基因组范围CRISPR/Cas9敲除筛选得到一系列在线粒体/溶酶体膜功能、大分子催化、ATP代谢和细胞分泌方面的基因，并验证了影响线粒体进入溶酶体以及溶酶体分泌过程的必须基因（图3）。

图3 氟桂利嗪诱导的mitolysosome介导线粒体外排通路

（图源：Bao, et al., Sci Adv,2022）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究从动物体到细胞再到基因水平层层深入，阐释了氟桂利嗪（flunarizine）诱发帕金森综合征的线粒体质量控制机制。文章揭示了氟桂利嗪诱导线粒体与溶酶体融合，并通过胞吐进行清除的新途径，与经典和非经典自噬依赖的线粒体质量控制途径有明显区别。除了表现于帕金森综合征病理中，该胞吐途径可能具有其他方面广泛的生理病理意义。另一方面，作者将氟桂利嗪用于在人皮肤成纤维细胞，小鼠成纤维细胞和Hela细胞中清除线粒体并获得了成功。因此，该研究可作为一种在免去复杂的基因改造过程进行清除线粒体，进而获得不含线粒体的真核细胞的方法，在研究细胞物质代谢、氧化应激或提高细胞重编程效率等方面作为细胞模型具有一定的应用前景。

然而，氟桂利嗪引发线粒溶酶体胞吐的各级通路还有待阐明。作者猜想可能是由于氟桂利嗪抑制电子传递链的复合物I和II从而干扰了线粒体呼吸作用[7]，也可能是破坏线粒体膜电位、干扰了线粒体膜功能等原因。线粒溶酶体（mitolysosome）模式的实现和影响值得继续深入探索，如何从线粒体质量控制的角度去解释神经退行性疾病和提供治疗方案也是很有意义的方向。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abk2376

第一作者包飞翔副研究员（左一），通讯作者刘兴国研究员（中）和浙江大学田梅教授（右一）。

（照片来源自供自：刘兴国实验室和浙江大学官网）

该工作得到了国家重点研发计划项目、中国科学院战略性先导研究计划项目、国家自然科学基金项目、广东省科技计划项目等的支持。本研究的帕金森症表型部分与中山大学黎明涛教授团队合作完成，线粒体自噬部分与南开大学陈佺教授团队合作完成，并得到郑州大学等多个团队的合作。

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通讯作者简介（上下滑动阅读）  

刘兴国，研究员，博士生导师，获得国家自然科学“杰出青年”基金，国家重点研发项目首席科学家, 广东省科学技术奖自然科学一等奖第一完成人，树兰医学青年奖。获得2016年干细胞青年研究员奖，国际生物物理学会评为“2011 Young Bioenergeticist Award”，任Science Bulletin（《科学通报》英文版）执行编委，亚洲线粒体研究与医学学会常务理事，中国生物物理学会常务理事。刘兴国研究员在国际杂志上共发表论文57篇，被引超过3000次，其中以通讯或第一作者40余篇。2015年以来以通讯作者发表研究论文23篇（篇均影响因子>12），其中17篇唯一通讯作者发表在Cell Metabolism（2篇）、Nature Metabolism、 Nature Structural & Molecular Biology、Hepatology、 Advanced Science、Science Advances、 Autophagy（2篇）等杂志，6篇共同通讯作者发表在Science Advances、The EMBO Journal、 Cell Death & Differentiation等杂志。论文3篇获得F1000推荐，6篇为封面故事，受邀在国家自然科学基金委《中国科学基金》发表长文综述（封面）。授权专利6项（含一项PCT）。60余次在国际学术大会上进行大会报告。

田梅，影像医学与核医学专业教授，博士生导师。教育部“长江学者”特聘教授、国家杰出青年科学基金获得者、科技部“重点领域创新团队”负责人。中国青年五四奖章、中国青年科技奖、中国青年女科学家奖、树兰医学青年奖获得者、全国三八红旗手。世任界分子影像学会(WMIS)主席、中国认知科学学会分子影像分会理事长，在多家国际知名核医学、分子影像学期刊担任主编、编委、顾问等职务。

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参考文献（上下滑动阅读）  

[1]  Lees AJ, Hardy J, Revesz T. Parkinson's disease [published correction appears in Lancet. 2009 Aug 29;374(9691):684]. Lancet. 2009;373(9680):2055-2066.

[2] Holmes B, Brogden RN, Heel RC, Speight TM, Avery GS. Flunarizine. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use. Drugs. 1984;27(1):6-44.

[3]  Ambrosio C, Stefanini E. Interaction of flunarizine with dopamine D2 and D1 receptors. Eur J Pharmacol. 1991;197(2-3):221-223.

[4]  Narendra D, Tanaka A, Suen DF, Youle RJ. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 2008;183(5):795-803.

[5]  Honda S, Arakawa S, Nishida Y, Yamaguchi H, Ishii E, Shimizu S. Ulk1-mediated Atg5-independent macroautophagy mediates elimination of mitochondria from embryonic reticulocytes. Nat Commun. 2014;5:4004. Published 2014 Jun 4.

[6]  McLelland GL, Soubannier V, Chen CX, McBride HM, Fon EA. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. EMBO J. 2014;33(4):282-295.

[7]  Veitch K, Hue L. Flunarizine and cinnarizine inhibit mitochondrial complexes I and II: possible implication for parkinsonism. Mol Pharmacol. 1994;45(1):158-163.

制版︱王思珍

本文完